Browsing by Author "LHERISSON, Christine"

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    ANALYSE DES FORMES MOLECULAIRES DE SOMATOSTATINE SECRETEES PAR UNE LIGNEE DE CELLULES TUMORALES ENDOCRINES DE PANCREAS DE RAT (RIN T3) : IMMUNO- DETECTION ET PURIFICATION D'UN PRECURSEUR
    (Université Mouloud MAMMERI FACULTE DE MEDECINE TIZI-OUZOU, 1990-04-02) LHERISSON, Christine
    Résumé : Les peptides "somatostatine" jouent un rôle fondamental dans la régulation des fonctions neuro- endocrines, centrales et périphériques, ainsi que dans le contrôle de nombreux phénomènes sécrétoires et moteurs, en particulier au niveau digestif. A ce large spectre d'action, des travaux plus récents ajoutent un effet anti-prolifératif à la fois "in vivo" et "in vitro". Malgré cet effet ,la biosynthèse et la sécrétion du peptide a été décrite pour des lignées cellulaires établies. Ce travail montre que les cellules tumorales endocrines RINT3 biosynthétisent et exportent de fortes quantités de somatostatine dosée par radioimmunologie. La somatostatine accumulée dans le milieu de culture n'inhibe pas la croissance de ces cellules. Devant cette apparente contradiction, nous avons décidé d'analyser plus précisément les formes moléculaires de somatostatine, produites par la lignée RINT3 issue d'un cancer radio-induit chez le rat. En effet, s'il est maintenant bien établi que les formes courtes somatostatine-15-28 (S15-26) et somatostatine-28 (S28) corrrespondent aux produits de maturation de précurseurs biosynthétiques, le rôle respectif de ces différentes formes n'est pas clairement défini. La première partie de notre travail a été consacrée à la mise au point d'un immuno-transfert adapté à la détection des différentes formes moléculaires de somatostatine dans le milieu de culture.Par cette méthode, nous avons confirmé des résultats obtenus par analyses chromatographiques suivies de dosages radioimmunologiques, en faveur de l'exportation, dans le milieu de culture, de composés de haut poids moléculaire. Un précurseur de somatostatine de 15 kD est sécrété de façon prédominante. L'étude par immuno-transfert montre que ce dernier est identique à la prosomatostatine hypothalamique extraite du cortex de rat. Cette proforme est spécifiquement détectée par deux groupes d'anticorps dirigés contre des épitopes différentes de la S28. Une faible partie de ce précurseur est retrouvée sous une forme de plus haut poids moléculaire 29 kD convertible en 15 kD par réduction. Cette prédominance de précurseur dans le milieu extracellulaire suggère un défaut dans les processus de maturation post-traductionnels, conduisant à la production de formes non maturées. Ce défaut de maturation pouvant être lié à une modification de la structure primaire du précurseur, nous avons abordé par la suite une purification du peptide de 15 kD en vue de son séquençage.Les paramètres mis en jeu pour purifier la prosomatostatine sont la taille, la charge et l'hydrophobicité. Les modes de séparation par échange d'ions et polarité de phase inverse, utilisés en chromatogaphie liquide haute performance, ont été combinés. Ils ont permis de séparer plusieurs espèces immunoréactives, la proforme de 15 kD étant localisée dans les éluats par immuno-transfert. Si ces deux étapes enchainées procurent un coefficient de purification important, l'apport de la chromatographie de tamis moléculaire en étape préliminaire est très favorable pour l'élimination de protéines contaminantes de plus haut poids moléculaire. Cependant, les trois techniques chromatograhiques ne peuvent être enchainées qu'après enrichissement sélectif du matériel en immunoréactivité. Pour cela, des études de sécrétion en milieu minimum ont été réalisées. L'augmentation du calcium extracellulaire stimule de façon dose-dépendante la sécrétion de la somatostatine. De même, l'action d'un ester de phorbol tel que le TPA accélère cette sécrétion tandis que la CCK et la Forskoline n'ont qu'un faible effet. Ces résultats montrent que la libération de somatostatine dans le milieu de culture est stimulable. Ce travail démontre qu'il existe bien un défaut de maturation dans la biosynthèse de la somatostatine, associé à l'exportation d'un précurseur dans le milieu. Son poids moléculaire a pu être établi à 15 kD. De plus, un enchainement de techniques permettant de purifier la proforme au sein des composants du milieu de culture a été proposé.Le milieu defini, correspondant à la collecte d'une solution stimulée par le calcium (5 mM ), doit fournir un matériel adapté à la purification du précurseur .