ANALYSE DES FORMES MOLECULAIRES DE SOMATOSTATINE SECRETEES PAR UNE LIGNEE DE CELLULES TUMORALES ENDOCRINES DE PANCREAS DE RAT (RIN T3) : IMMUNO- DETECTION ET PURIFICATION D'UN PRECURSEUR
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Date
1990-04-02
Authors
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Publisher
Université Mouloud MAMMERI FACULTE DE MEDECINE TIZI-OUZOU
Abstract
Résumé :
Les peptides "somatostatine" jouent un rôle
fondamental dans la régulation des fonctions neuro-
endocrines, centrales et périphériques, ainsi que dans le
contrôle de nombreux phénomènes sécrétoires et moteurs,
en particulier au niveau digestif. A ce large spectre
d'action, des travaux plus récents ajoutent un effet
anti-prolifératif à la fois "in vivo" et "in vitro".
Malgré cet effet ,la biosynthèse et la sécrétion du
peptide a été décrite pour des lignées cellulaires
établies.
Ce travail montre que les cellules tumorales endocrines
RINT3 biosynthétisent et exportent de fortes quantités de
somatostatine dosée par radioimmunologie. La
somatostatine accumulée dans le milieu de culture
n'inhibe pas la croissance de ces cellules. Devant cette
apparente contradiction, nous avons décidé d'analyser
plus précisément les formes moléculaires de
somatostatine, produites par la lignée RINT3 issue d'un
cancer radio-induit chez le rat.
En effet, s'il est maintenant bien établi que les formes
courtes somatostatine-15-28 (S15-26) et somatostatine-28
(S28) corrrespondent aux produits de maturation de
précurseurs biosynthétiques, le rôle respectif de ces
différentes formes n'est pas clairement défini.
La première partie de notre travail a été consacrée
à la mise au point d'un immuno-transfert adapté à la
détection des différentes formes moléculaires de
somatostatine dans le milieu de culture.Par cette
méthode, nous avons confirmé des résultats obtenus par
analyses chromatographiques suivies de dosages
radioimmunologiques, en faveur de l'exportation, dans le
milieu de culture, de composés de haut poids moléculaire.
Un précurseur de somatostatine de 15 kD est sécrété de
façon prédominante. L'étude par immuno-transfert montre
que ce dernier est identique à la prosomatostatine
hypothalamique extraite du cortex de rat. Cette proforme
est spécifiquement détectée par deux groupes d'anticorps
dirigés contre des épitopes différentes de la S28. Une
faible partie de ce précurseur est retrouvée sous une
forme de plus haut poids moléculaire 29 kD convertible en
15 kD par réduction. Cette prédominance de précurseur
dans le milieu extracellulaire suggère un défaut dans les
processus de maturation post-traductionnels, conduisant à
la production de formes non maturées. Ce défaut de
maturation pouvant être lié à une modification de la
structure primaire du précurseur, nous avons abordé par
la suite une purification du peptide de 15 kD en vue de
son séquençage.Les paramètres mis en jeu pour purifier la
prosomatostatine sont la taille, la charge et
l'hydrophobicité.
Les modes de séparation par échange d'ions et polarité de
phase inverse, utilisés en chromatogaphie liquide haute
performance, ont été combinés. Ils ont permis de séparer
plusieurs espèces immunoréactives, la proforme de 15 kD
étant localisée dans les éluats par immuno-transfert. Si
ces deux étapes enchainées procurent un coefficient de
purification important, l'apport de la chromatographie de
tamis moléculaire en étape préliminaire est très
favorable pour l'élimination de protéines contaminantes
de plus haut poids moléculaire. Cependant, les trois
techniques chromatograhiques ne peuvent être enchainées
qu'après enrichissement sélectif du matériel en
immunoréactivité.
Pour cela, des études de sécrétion en milieu minimum
ont été réalisées. L'augmentation du calcium
extracellulaire stimule de façon dose-dépendante la
sécrétion de la somatostatine. De même, l'action d'un
ester de phorbol tel que le TPA accélère cette sécrétion
tandis que la CCK et la Forskoline n'ont qu'un faible
effet. Ces résultats montrent que la libération de
somatostatine dans le milieu de culture est stimulable.
Ce travail démontre qu'il existe bien un défaut de
maturation dans la biosynthèse de la somatostatine,
associé à l'exportation d'un précurseur dans le milieu.
Son poids moléculaire a pu être établi à 15 kD. De plus,
un enchainement de techniques permettant de purifier la
proforme au sein des composants du milieu de culture a
été proposé.Le milieu defini, correspondant à la collecte
d'une solution stimulée par le calcium (5 mM ), doit
fournir un matériel adapté à la purification du
précurseur .
Description
Keywords
RAT (RINT3), CELLULE TUMORALE ENDOCRINE, PANCRÉAS, SOMATOSTATINE SECRETEE : FORME MOLECULAIRE, IMMUNO-DETECTION : PRECURSEUR, PURIFICATION : PRECURSEUR