Etude de la maturation du précurseur des glycoprotéines d'enveloppe (gp160) du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) : Développement d'inhibiteurs protéiques et peptidiques, et caractérisation biochimique des enzymes impliquées
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Date
2001-10-23
Authors
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Publisher
Université Mouloud MAMMERI FACULTE DE MEDECINE TIZI-OUZOU
Abstract
Le clivage du précurseur des glycoprotéines d'enveloppe gp160 (Env) du virus de
l'immunodéficience humaine (VIH) ou simienne (VIS) en gp120 (SU) et gp41 (TM) est une
étape clef du cycle viral. Tout blocage de cette étape conduit à des virus qui ne sont plus
infectieux. Ce clivage est catalysé par des endoprotéases de la cellule hôte, et il a lieu au niveau
d'un site conservé entre la majorité des virus enveloppés, et de séquence consensus R-X-R/K-R.
L'objectif de ce travail est de tester et développer des inhibiteurs spécifiques de cette étape et de
caractériser les endoprotéases cellulaires responsables de cette maturation. Deux types
d'inhibiteurs ont été testés : i) protéiques qui sont dérivés d'inhibiteurs naturels plasmatiques
des sérine-protéases comme Pal-antitrypsine en introduisant par mutagenèse dirigée dans leurs
sites actifs, la séquence de clivage de la gp160 (RXKR); ii) peptidiques dont les séquences sont
dérivées de la région de la gp160 aux alentours du site de la maturation (REKR). Dans
I'approche des inhibiteurs protéiques, nous avons évalué le rôle du variant de Portland de l'al -
antitrypsine (al-PDX) qui a été obtenu par mutagenèse dirigée en greffant la séquence RXXR
dans le site'actif de l'al-antitrypsine, à interférer avec la réplication virale du VIH-1 et VIH-2,
l'induction des syncytia, et avec la maturation de la glycoprotéine d'enveloppe Env en SU
(gp120 pour VIH-1, et gp125 pour VIH-2) et TM (gp41 pour VIH-1, et gp36 pour VIH-2). Dans
cet objectif, des cellules Jurkat (lignée lymphocytaire CD4+) stablement transfectées par le
plasmide pcDNA3 contenant l'ADNc de l'al -PDX ont été infectées par le VIH-1 et/ou VIH-2.
Comme contrôle, des cellules Jurkat ont été transfectées dans les mêmes conditions par le
plasmide pcDNA3 seul. Les résultats obtenus montrent que l'al -PDX bloque fortement, mais
non totalement, la réplication virale et l'induction de la formation des syncytia en interférant
avec la maturation de la gp160 en gp120 et gp41. Des résultats similaires ont été obtenus avec le
VIFI-2. Contrairement aux virus produits en présence de l'al -PDX durant les deux premières
semaines, l'analyse des virus produits après trois semaines, montre qu'ils retrouvent leur pouvoir
infectieux. Le séquençage de la région contenant le site du clivage de la gp160 montre que cet
échappement n'est pas dû à des mutations du gène env. Par contre, cet échappement viral semble
être associé à une forte protéolyse de l'al-PDX. Le mécanisme moléculaire responsable de cette
dégradation au cours de l'infection VIH-1 reste à déterminer. Dans la deuxième approche. nous
avons ciblé l'inhibition de la maturation de la gp160 à l'aide de peptides synthétiques contenant
la séquence consensus R-X-K/R-R du site potentiel du clivage de la gp160, qui ont été associés
du côté N-terminal à un groupement décanoyl (dec) pour faciliter leur passage de la barrière
membranaire. et du côté C-terminal à un groupement chlorométhylcétone (cmk) permettant
l'établissement. après la formation du complexe enzyme-inhibiteur, d'une liaison covalente
irréversible qui fait de ces peptides, des inhibiteurs suicides. Ainsi, nous avons testé la capacité
des peptides decRVKRcmk, decl 4D (TKAKRRVVEREKRV) et decl4Dcmk à bloquer la
réplication virale des VIH et/ou celle du VIS. Nos résultats montrent que ces peptides inhibent
la réplication des virus VIH-1. VIH-2 et VIS par un mécanisme qui semble similaire à celui que
nous avons décrit pour l'al -PDX. La caractérisation enzymatique de ces substrats, montre que
le peptide dec I4D n'est dégradé ni par la furine ni par la PC7 (sérine-endoprotéases de la famille
des prohorrnones convertases). De plus. ce peptide semble mieux inhiber la PC7 (Ki= 4,5
que la furine (Ki > 150 µM). Nous avons donc utilisé cette spécificité du peptide dec 14D d'être
reconnu par les endoprotéases cellulaires sans être dégradé. en chromatographie d'affinité pour
purifier à partir des lymphocytes du sang périphérique (cellules cibles du VIH-1) les
endoprotéases impliquées dans la maturation du précurseur Env. Après trois étapes de
purifications supplémentaires incluant des filtrations moléculaires et chromatographies d'affinité
sur ions Zn++, nous avons purifié un hétéro-dimère composé de trois sous-unités de 66, 32 et 24
kDa, qui est capable de cliver correctement la gp160 en gp120 et gp41 en absence totale du
calcium. La caractérisation à l'aide d'inhibiteurs enzymatyiques montre qu'il s'agit d'une sérine-
endoprotéase avant un pH optimum entre 6,5 et 7. Cette contribution supporte l'hypothèse que la
maturation de la gp160 du VIH-1 impliquerait au moins deux familles d'endoprotéases en
fonction de la dépendance du calcium.
Description
Keywords
virus de l'immunodéficience humaine, Glycoprotéine, Inhibiteur protéique, Enzyme, glycoprotéines d'enveloppe gp160